液相色谱技术在附子及其制剂质量检测的应用

赵佳，高一，陈丹，裘兰兰^*   

（江苏医药职业学院，江苏盐城，224006）

[摘  要]采用回顾文献，总结归纳的形式总述了近几年国内外研究工作者对附子及其相关制剂质量检测方法的研究成果。重点介绍了液相色谱法及液相色谱-质谱联用技术在对附子及相关制剂进行有效成分分析及毒性成分分析的具体操作方法，同传统方法相比，色谱及色谱质谱联用技术相关系数好，准确度高，灵敏度高，且分离出的成分更多。

[关键词]附子；薄层色谱法；液相色谱法；液-质联用技术

[基金项目] 江苏省大学生实践创新项目“HPLC-MS测定不同炮制方法对中药白附子中的有效成分及毒性成分含量的影响”（201612682002Y）；江苏省高等职业教育产教融合平台立项项目（苏教[2019]31号）；

[作者简介]赵佳（1997-），女，江苏医药职业学院在校学生

[通讯作者]裘兰兰（1983-），女，江苏医药职业学院药学讲师，研究方向为药品质量检测方法的建立

[中图分类号]TS207.3        [文献标识码]A      

附子具有回阳救逆，补火助阳，散寒止痛等功效。现代药理学研究证实附子具有强心、抗休克、抑制凝血功能和抗血栓形成等作用^[1-2]。附子中成分复杂，含乌头碱、中乌头碱、次乌头碱、塔拉乌头胺、新乌头碱、北乌头碱、多根乌头碱和附子苷等成分。乌头碱类化合物作为附子中的主要活性成分临床药效显著，因此研究中常将生物碱含量的高低作为评价附子质量的重要指标，其成分中的多样性对检测方法的要求较高。本文综述了液相色谱法及液-质联用技术在附子及各类制剂检测方面的应用，将为其他研究者进行附子及其制剂检测时提供有效的参考手段。

1.液相色谱法在附子及其制剂检测方面的应用

液相色谱（HPLC）法由于其专属性强且灵敏度高的特点而广泛用于附子的检测。崔敏 等采用HPLC法对生附子中乌头碱及次乌头碱的含量进行测定，测定得出生附子中乌头碱的平均含量为0.0082%，RSD=2.69%，次乌头碱的平均含量为0.0224%，RSD=0.93%。炮制后测得附子中所含的乌头碱以及次乌头碱的含量均要高于非炮制品。张霞 等采用HPLC法对人血浆中新乌头碱、乌头碱、次乌头碱和苯甲酰新乌头原碱的含量进行了测定， 通过检测血液中的苯甲酰新乌头原碱考察出新乌头碱，乌头碱和次乌头碱在人体内的减毒情况。。

吴子春等用HPLC法测定了乌头碱、中乌头碱和次乌头碱的含量，有效的控制了附子炮制品的质量。杨海宁 等建立HPLC法测定生附子中三种双酯型生物碱的含量，采用酸水提取附子中双酯型生物碱，乙腈与四氢呋喃以9:1混合作为有机相时，三种双脂型生物碱分离度良好。双脂型生物碱稳定性差，经炮制和煎煮可水解成苯甲酰类单脂型生物碱及原碱，随时间变化其含量呈现一定规律的变化。HPLC法简便易行、准确度高、重复性好，适用于附子中乌头碱及次鸟头碱的含量测定，可作为附子质量控制的方法。

2.HPLC-MS法在附子及其制剂检测方面的应用

HPLC-MS 用于成分的鉴定，避免了采用对照品核对成分峰鉴定方式的局限性。唐小龙等采用HPLC-MS法对附子煎煮过程中化学成分的变化进行分析，从36种鉴定的化合物中，选取了含量较高的25种化合物作为分析对象，分为双酯型生物碱、单酯型生物碱、醇胺型生物碱和其他生物碱。结果表明在附子煎煮的过程中，约2h后几乎检测不出毒性较强的双酯型生物碱；6-8h左右毒性较小的单酯型生物碱在逐渐升高的过程中达到顶峰，之后自最高点开始逐渐降低；醇胺型生物碱则一直保持着升高的状态；其他生物碱呈现出先逐渐升高，后略微降低的状态，总体上趋于相对的平衡，含量在6-8h的区间达到顶峰。由实验结果可知，煎煮时间须达2h以上，才可基本消除附子煎煮过程中所产生的毒性物质。

蒋荡等采用HPLC-MS检测方法测定了不同秸杆覆盖处理的附子中3种生物碱的成分。结果表明附子中所含乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的含量分别在 0.70~35.00 ng(r=0.9996)、0.50~25.00 ng (r=0.9996)、1.06~53.00ng

(r=0.9980)范围内线性良好；平均回收率分别为100.7%、99.2%和98.9%。

王海燕等采用 HPLC-MS 联用技术对不同提取方法制备的四逆汤中主要化学成分进行了结构的指认。共定性出传统水提液28个化学成分，有效部位组合液中30个化学成分，并对各成分的药材归属进行了确认，为确定四逆汤的药效成分物质基础提供重要依据。黄铮等应用HPLC 法建立了四逆汤中附子生物碱的特征图谱，测定附子等物质的特征图谱，采用HPLC-MS法推测其特征峰的组成，探讨配伍对四逆汤中附子生物碱的变化。实验结果以苯甲酰新乌头原碱为参比峰，分别标定18个特征峰，其中附子含有8个特征峰，干姜和甘草水煎液含有8个特征峰， 配伍后，来源于附子的10个特征峰峰面积均出现不同程度的降低，甚至出现特征峰消失的现象，可得出配伍对四逆汤中来源于附子的特征峰有较为显著的影响，并且溶出量明显降低。

为探讨附子配伍甘草减毒的可能机制，并为含附子-甘草药对的中药成方制剂的提取纯化工艺合理性提供实验依据。章津铭等采用HPLC-MS分别对中药附子配伍甘草前后的汤液中产生的沉积物进行了化学组成的鉴定，建立了附子单煎液沉积物与附子甘草合煎液沉积物 HPLC-MS 指纹图谱。从附子单煎液沉积物中指认出28种成分；从附子甘草合煎液沉积物中指认出36种成分，其中11种来源于甘草， 25种成分来源附子。配伍甘草前后汤液沉积物中生物碱成分种类、含量差别均较大，由此可得配伍甘草可能导致汤液中附子生物碱成分状态的改变，这一现象为附子-甘草配伍减毒机制的探讨提供了充分的实验依据，也提示了附子与甘草煎煮液沉积物中含有其他的有效成分。

与常用的液相色谱法相比，HPLC-MS 法具有灵敏度更高、专属性更强等优点，可满足药物质量控制的需要。在附子及其制剂的检测方面，对毒性成分的检测及制剂过程中相关成分变化的监测占据着重要的地位。

     综上所述，国内外研究工作者对附子及其制剂中有效成分及毒性分析的分离鉴定及质量检测的研究不断发展，出现了许多基于不同原理及不同研究目的的检测方法，应用最多的是液相色谱法和液相色谱-质谱联用方法。本文综述了这两种方法的基本原理、研究现状、各自优缺点及发展动态，为掌握中药附子及各类制剂的质量检测提供科学依据。随着检测技术的不断更新，对附子中的未知成分的鉴定、有效成分的精准测量以及毒性成分的控制的目标将会实现。

[参考文献]

[1] 吴克红,唐力英,王祝举等.附子的化学和生物活性研究进展[J].中国实验方剂学杂志.2014,20(2):212-220.

[2] 陈亚玲,袁小虹,侯大斌等.生附子中二萜生物碱化学成分及其杀虫活性的研究[J].安徽农业科学,2009,37(10):4536-4537.

[3] 崔敏，杨武德. HPLC法测定生附子及其炮制品中乌头碱及次乌头碱的含量 [J]贵阳中医学院学报，2012,34(6):3-6

[4] 张霞，陈迎平.HPLC同时测定人血浆中新乌头碱、乌头碱、次乌头碱和苯甲酰新乌头原碱的含量[J]中药材，2014,37（8）:1407-1409

[5] 吴梓春,刘肖林.高效液相色谱法同时测定中药附子中乌头碱、中乌头碱和次乌头碱的含量[J].北方药学,2017,14(01):11+135.

Application of Liquid Chromatography in Quality Detecting

Methods of Aconite Lateralis and Its Preparations

Zhao Jia, Gao Yi, Chang Meiyu, Chen Dan, Chen Qin, Wu Xiaofeng, Qiu Lanlan^*

(Jiangsu Vocational of Medicine， Jiangsu Yancheng, 224006)

Abstract: By reviewing the literature, this paper summarizes the research results of domestic and foreign researchers on the quality detection methods of Aconitum carmichaeli and its related preparations in recent years. The specific operation methods of liquid chromatography and liquid chromatography-mass spectrometry in the analysis of effective components and toxic components of Aconitum carmichaeli and related preparations are emphatically introduced. Compared with traditional methods, the chromatography-mass spectrometry technology has good correlation coefficient, high accuracy, high sensitivity and more separated components.

Keywords: Aconitum carmichaeli; TLC; HPLC; HPLC-MS